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酵母感受态细胞的制备及质粒的转化

（1）    抽提BD和AD的相关质粒（浓度最好在100-200ng/μL）；

（2）    预先灌制好需要的平板及各种培养基；

（3）   酵母感受态的制备：

1）           将酵母菌株(AH109或者是其他的菌株)在YPDA培养基平板上划线，30℃倒置培养3天左右，直到克隆大小为2-3mm；

2）           挑取一个酵母克隆于7.5ml的YPDA液体培养基中（50ml灭菌的离心管），30℃并且振荡(转速200rpm)培养24h左右；

3）           将这7.5ml菌液接入大体积（体积视转化个数确定）YPDA液体培养基中6h左右，30℃  200rpm 振荡培养；

4）           室温4000rpm离心5min以收集菌体，倒去上清并用40ml无菌去离子水重悬酵母；

5）           室温4000rpm离心5min以收集菌体，倒去上清并用3ml 1.1×TE/LiAc溶液重悬酵母；

6）           将重悬液分装为2个1.5ml的离心管，4000rpm离心1min；

7）           倒去上清，并将酵母重悬于600ul1.1×TE/LiAc溶液；

8）           在一个1.5ml灭菌的干净离心管中加入以下组分；

10ul herring testes carrier DNA (使用前在95°C水浴锅中变形10分钟,立即放在冰上5min,以后使用，就不需要变性),具体设置的实验如下:

	实验组	阴性对照1	阴性对照2	用量
1	BK-bait	pGBKT7	BK-bait	0.2ug
2	AD-prey	AD-prey	pGADT7	0.1ug

 9) 将100ul 感受态细胞加入到DNA中；

10)加入600ul PEG/LiAc solution 快速彻底的混匀；

11) 放置于30℃并且振荡(转速200rpm)培养30分钟；

12) 每管加入70μl DMSO，轻轻上下颠倒混匀,42℃水浴热激15分钟；

13) 冰浴2分钟, 4000rpm，2分钟离心收集菌体，弃上清；

14)用500ul TE（PH 8.00）重悬菌体，离心4000rpm，2分钟离心收集菌体，弃上清，最后用50ul TE重悬菌体涂布于相应的SD-Trp/-Leu固体平板上，30℃ 倒置培养 3天左右，直到长出所需大小的克隆；

15）挑取平板上大小合适的克隆，并在700ul的SD-Trp/-Leu液体培养基中30℃震荡过夜培养，然后按1:10,1:100,1:1000的稀释比转移到SD-Trp/-Leu/-His及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade固体培养基上培养，大约2天左右即可看到菌落的生长情况

16）对于在SD-Trp/-Leu/-His或者是SD-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上生长良好，而阴性对照没有生长的平板可以照相保存（若有由于His渗漏表达造成的背景杂菌，可在培养基中加入1mM  3-AT进行抑制）。

酵母相关试剂的配制：

1    YPD培养基（1L）

PEPTONE                 20g

Yeast extract               10g

加ddH2O 溶解后，定容至1L,并用KOH调PH至5.80，（若为固体加入Agar  20g），高压灭菌。如要铺置平板，则在稍冷却后加入40％的葡萄糖溶液（终浓度2％）。

1 2.     YPDA培养基（1L）

1L YPD液体培养基中加入15ml 0.2％Adenine hemisulfate 溶液（终浓度为0.03％）

1 3.     SD-Trp/-Leu和SD-Trp/-Leu/-His培养基的配置（1L）

Minimal SD base（Clontech）    26.7g

SD--Trp/-Leu    0.64g，SD-Trp/-Leu/-His   0.62g及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade   0.60g

加水溶解并定容至1L,并且调pH到5.80，若为固体培养基则加入20g Agar（终浓度2％），并高压灭菌（121°C 灭菌15min）

1 4.      1.1 ×TE/LiAc

现配现用：1.1ml  10×TE和1.1ml 1M  LiAc ,用无菌去离子水补充至10ml。

1 5.      PEG/ LiAc

现配现用：1ml  10×TE和1ml 1M  LiAc ,然后用50％ PEG3350 溶液补至10ml

 

注意问题：

1 做酵母时，1.1 ×TE/LiAc，PEG/ LiAc混合溶液都需要现配现用；

2 当目的蛋白在LT长得比较少，可考虑提高酵母感受态的浓度；

3 在加入DMSO以后，切记不要剧烈的震荡，否则影响感受态的效率；

4 所有的步骤都是在超净台中进行，防止其他杂菌污染；

5 SD--Trp/-Leu，SD-Trp/-Leu/-His 及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade 加水溶解并定容至1L,并且调pH到5.80，务必要调节pH，否则到时候涂板时，后出现培养基很松软，导致涂板时，培养基破裂变成渣渣，耽误实验；


  6.当目的蛋白出现自激活时，有以下解决方法：

    1)   加入一定浓度的3AT（如1mM）；

    2)   如果目的蛋白在AD上有自激活，就换到BD那一边；

    3） 可以放在25°C培养；

    4） 如果还是解决不了，考虑截短目的蛋白。